776.安全第一

　　遠隔效應是指放射治療期間或之后放射野外腫瘤的消退，已在各種癌癥中報道，例如黑色素瘤、腎細胞癌和乳腺癌。雖然其機制尚未完全闡明，但遠隔效應可能是由輻射誘導的全身免疫反應增強介導的。然而，很少觀察到遠隔效應，可能是因為癌細胞的免疫逃逸機制，包括免疫檢查點通路的激活。在過去十年中，新開發的免疫檢查點抑制劑徹底改變了癌癥治療。隨著可增強針對癌細胞的全身免疫反應的ICI的出現，結合ICI和放療的新治療方案有望增強遠隔效應。正在積極研究ICI和RT的協同效應，并且在各種報告中都研究了這種組合增強遠隔效應的潛力。

　　肝細胞癌是最常見的原發性肝癌類型，也是世界范圍內癌癥相關死亡的第二大原因。早期HCC患者接受切除、肝移植和消融等治療方式的總生存率>60，而接受化療栓塞或全身治療的晚期HCC患者預后不佳。為了改善這種不良結果，最近在HCC治療中加入并建議了新方案，包括考慮使用ICI。因此，各種ICIs，包括程序性細胞死亡1抑制劑、PD配體1抑制劑和細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4抑制劑，在HCC患者中的可行性和安全性正在研究中。然而，報道的ICIs的客觀緩解率僅為1520，仍不令人滿意。此外，最近評估派姆單抗治療晚期HCC患者療效和安全性的KEYNOTE240試驗未能顯示與安慰劑相比在總生存期和無進展生存期的改善方面具有統計學意義。由于其免疫原性引起的遠隔現象，RT在用于提高ICI對晚期HCC的療效方面受到了相當大的關注。

　　最近在一些臨床前實驗和臨床試驗中檢測了協同治療在控制原發性HCC中的功效。然而，這些先前的研究沒有使用轉移性HCC模型，而是使用原位模型，這只能觀察RT和ICI對原發腫瘤的聯合作用，而不是遠隔效應。因此，在本研究中，我們旨在使用雙側小鼠同源HCC模型研究輻射對遠隔現象的作用和免疫學機制，以及抗PD1抗體對遠隔效應的影響。

　　使用Hepa16細胞建立同系雙側HCC小鼠模型。腫瘤生長曲線顯示，與未照射的腫瘤相比，使用總劑量16Gy分兩次照射而不是在單次使用8Gy更顯著地抑制照射腫瘤生長和未照射的腫瘤生長。對第31天收獲的腫瘤進行拍照，與單次8Gy照射相比，分兩次總劑量16Gy照射顯著提高小鼠的存活率的浸潤。此外，總劑量16Gy分兩次照射還增加了受照射腫瘤中調節性T細胞的浸潤。

　　為了了解局部照射如何縮小未照射的腫瘤，我們使用流式細胞術檢測了小鼠右后腿的腫瘤引流的腹股溝淋巴結中的DCs。數據顯示，總劑量16Gy分兩次照射顯著增加了TDLN中活化DCs比例，這由CD40和CD80的高表達所證明。TDLN中CD11cDC上的共抑制分子PDL1的表達也由總劑量16Gy分兩次照射誘導。此外，總劑量16Gy分兩次照射顯著增加了CD4IFNγ和CD8IFNγT細胞，激活了TDLN中的T細胞。Tregs在TDLN中的積累在總劑量16Gy分兩次照射組中也比單個8Gy照射組更明顯。

　　基于顯示輻射增加TDLNDC中PDL1表達的結果，我們確定了PD1/PDL1通路的阻斷是否可以進一步增強同源雙側HCC小鼠的遠隔效應模型。抗PD1抗體比同型IgG對照更能抑制雙側Hepa16腫瘤的生長，但差異無統計學意義。總劑量16Gy分兩次照射抑制了受輻照和未受輻照的遠側腫瘤的生長。與單獨放療或抗PD1單藥治療相比，放療和抗PD1聯合治療進一步抑制了受輻射和未受輻射腫瘤的生長。用抗PD1抗體和輻射聯合治療的小鼠腫瘤明顯小于用輻射或抗PD1單一療法治療的小鼠的腫瘤。單獨的抗PD1治療并沒有提高生存率，但與放療相結合，它顯著提高了生存率。

　　使用CD4和CD8特異性抗體的免疫組織化學顯示，與IgG對照相比，單獨的抗PD1抗體和放療更顯著地增加了CD4和CD8細胞在照射腫瘤中的浸潤，CD4細胞向未放療的對側腫瘤的浸潤。用抗PD1抗體和輻射聯合治療進一步增強了CD8細胞向兩種腫瘤的浸潤，盡管沒有明顯的累加效應。

　　對第31天收獲的腫瘤進行流式細胞術分析表明，在受照射的腫瘤中，總劑量16Gy分兩次照射，而不是抗PD1抗體治療更顯著增加CD4和CD4IFNγT細胞的浸潤。類似地，總劑量16Gy分兩次照射增加了總CD8和CD8IFNγT細胞的浸潤。與單獨使用抗PD1抗體而不是單獨使用輻射相比，用抗PD1抗體和輻射聯合治療進一步增強了CD4和CD8T細胞的浸潤。放療和抗PD1抗體均增加了未受照射腫瘤中的CD4和CD4IFNγT細胞，但不增加CD8T細胞，而它們的聯合治療增加了總CD8和CD8IFNγT細胞超過任何一種單獨治療。與IgG對照治療相比，放射和抗PD1抗體的組合增加了兩側腫瘤中CD25CD4Foxp3Tregs的浸潤，而在各組之間沒有觀察到CD11cDCs的差異。

　　流式細胞術免疫表型分析顯示，CD220B細胞、F4/80巨噬細胞、Ly611b中性粒細胞、Ly611bLy6C單核骨髓源性抑制細胞和Ly611bLy6Clow粒細胞MDSCs的數量不受單一療法或聯合療法的影響，除了CD3T細胞。

　　遠隔效應是一種由輻射引起的罕見現象，可以通過免疫療法得到加強。盡管放射療法和免疫療法越來越多地用于治療肝細胞癌，但免疫療法是否可以增強遠隔效應仍不清楚。在這項研究中，旨在闡明在鼠HCC模型中由輻射和免疫治療相結合引起的遠隔效應的免疫學機制。通過將小鼠Hepa16HCC細胞接種到具有免疫活性的C57BL/6小鼠的兩條后腿上，建立同源HCC小鼠模型。右后腿的腫瘤被照射，在左后腿未照射的腫瘤中觀察到遠隔效應，有或沒有抗程序性細胞死亡1抗體的共同給藥。進行流式細胞術分析以分析浸潤受照射和未受照射的腫瘤以及腫瘤引流淋巴結的免疫細胞的分布。與單次8Gy照射相比，兩次共16Gy照射更有效地抑制了受輻射和未受輻射的腫瘤的生長，細胞毒性T細胞的腫瘤浸潤更高。更高的劑量還增加了TDLN中活化的樹突細胞，其具有更高的程序性細胞死亡配體1的表達。抗PD1抗體的共同給藥顯著增強了遠隔效應，并增加了受照射和非照射的活化細胞毒性T細胞的浸潤。受輻射的腫瘤。的研究結果表明，在放療中加入抗PD1療法可增強HCC同源小鼠模型的遠隔效應。

　　紅細胞的生成是一個被嚴格調控的過程。在穩態的血細胞生成過程中，骨髓每小時大約產生1010個紅細胞，以使血紅蛋白水平維持在一個很窄的范圍內。在持續失血或溶血的情況下，紅細胞的生成可快速增加。

　　骨髓的紅系祖細胞是定向分化的單系祖細胞，從有雙向或多向分化潛能的祖細胞隨機分化而來的。

　　有兩種紅系祖細胞不能通過特定的形態學特征予以識別，但能采用流式細胞技術予以純化和分析。有證據顯示所有造血祖細胞或干細胞與淋巴母細胞相似。

1、局部照射減少小鼠脾臟中腫瘤引起的Ter細胞聚集　　前期發現腫瘤誘導紅細胞祖細胞的產生與不良預后顯著相關，而靶向EPC或其產物可抑制腫瘤的進展。

　　LCC荷瘤小鼠脾腫大，放療后基本恢復正常大小。Ter119CD71EPCs放療后，其比例也明顯恢復到基線水平。此外，在MC38、B16SIY荷瘤模型中，也觀察到了放療后Ter細胞顯著減少的現象，表明放療誘導的Ter細胞減少并不局限于某種腫瘤類型。

2、IFNs與T細胞是輻射影響Ter細胞所必須的　　文獻報道放療可通過I型干擾素和T細胞觸發局部和全身抗腫瘤免疫，為了確定I型IFN在放療介導Ter細胞減少中的作用。采用IFNARKO小鼠，發現放療可使WT小鼠脾臟減小、脾細胞數量減少、Ter細胞數量減少，但IFNARKO小鼠中該現象消失。還對比了局部照射或外源性注射干擾素治療WT小鼠腫瘤的效果，發現兩者均可減少Ter細胞數量。這表明I型干擾素信號途徑對于放療介導的Ter細胞減少是必需的。

　　鑒于T細胞在放療抗腫瘤中具有一定作用，研究人員探索了T細胞在放療介導Ter細胞減少中的作用。采用免疫缺陷小鼠模型RAGKO，發現RAGKO小鼠放療后Ter細胞并未減少，表明放療誘導Ter細胞減少依賴于T細胞。

　　為探索是CD4或CD8亞群T細胞在其中發揮作用，采用抗體清除CD4或CD8T細胞后，發現清除CD8T細胞后，放療誘導的Ter細胞減少作用消失，表明是CD8而非CD4T細胞發揮作用。

3、通過阻斷PDL1可減少腫瘤誘導的依賴于CD8T細胞和IFNγ的Ter細胞聚集　　PDL1抑制劑能夠增強CD8T細胞的功能。PDL1抑制劑能否逆轉脾臟Ter細胞積累？對荷瘤小鼠腹腔注射PDL1抗體或進行放療，發現PDL1抗體或放療均抑制脾腫大和減少脾細胞，降低脾臟Ter細胞的比例和數量。

　　PDL1抗體還減少脾臟中ARTN的表達，降低血清中ARTN的濃度。因此，PDL1抗體可降低腫瘤誘導的Ter細胞積累和ARTN的產生，且其作用依賴于CD8T細胞和IFN。

4、Ter細胞和ARTN破壞放療或IO的療效　　體外試驗發現腫瘤細胞與Ter細胞共培養，或腫瘤細胞培養中外源加入ARTN，均可增強小鼠腫瘤細胞的抗輻射能力。而Ter細胞和ARTN會使CD8T細胞的細胞毒作用減弱。

　　在體內模型中，通過過繼性轉移Ter細胞或外源性注射ARTN減弱放療和PDL1抗體抗腫瘤作用。表明免疫治療和放療的治療作用部分依賴于它們對Ter細胞的抑制。

5、破壞Ter細胞ARTN軸可以促進放療或IO的療效　　破壞Ter/ARTN軸能夠提高放療和PDL1抗體的療效。antiTer119抗體耗竭小鼠Ter細胞后放療和PDL1抗體的作用提高，阻斷ARTN也能增強療效。

6、放療和IO應答患者顯示出治療導致的Ter細胞減少　　發現在接受放化療的NSCLC患者中，治療后沒有復發的患者治療后血液中ARTN濃度顯著降低，但治療后復發患者的血液中ARTN濃度無顯著變化。

　　一項臨床試驗發現患者接受放療后進行免疫治療，放療后完全或部分緩解患者的Ter細胞豐度顯著下降，腫瘤進展的患者中，Ter細胞豐度無顯著變化。表明患者對于放療和免疫治療的響應與其Ter細胞數量以及ARTN濃度相關。

研究小結　　放療和PDL1阻斷治療能夠降低腫瘤誘導產生的Ter細胞和ARTN水平，機制層面，放療和PDL1阻斷治療可使體內發生由干擾素、DCs和CD8T細胞介導的先天和適應性免疫應答，這些應答也是治療充分發揮療效所必需的，同時，阻斷Ter細胞ARTN軸可以促進放療和抗PDL1治療的效果。